Introduction to Single Molecule Sequencing

  • Single molecule sequencing

    A DNA strand polymerase is used to synthesize a DNA strand complementary to the template, and the position of the template and the nucleotide sequence information are recorded in a three-dimensional space, and the sequence of the DNA template is reversely constructed. In addition to the three major elements of the DNA synthesis reaction (template, enzyme, nucleotide), the position of the template and the nucleotide sequence of the monochromatic fluorescent label (such as A, C, G, T) in the reaction cycle are also the final DNA. The key elements that the sequence can accomplish. If the nucleotides used in the reaction are labeled with four different fluorescences, each reaction cycle requires switching different wavelengths of light to record different bases.


    Introduction to single molecule sequencing
    The SMRT technology is based on the idea of sequencing while synthesizing, and the sequencing reaction is carried out using the SMRT chip as a carrier. The SMRT chip is a metal piece with many zero-mode waveguides (ZMW) (100 nm thick). ZMW is a hole with a diameter of only a few tens of nanometers due to the small hole on the bottom. Shorter than the single wavelength of the laser, the laser can not directly pass through the small hole, but the light will be diffracted at the small hole to form a localized area, which is the fluorescent signal detection area, in which DNA polymerase is anchored.


    When sequencing, the DNA of the genomic DNA is broken into many small fragments, which are made into droplets and dispersed into different ZMW nanopores. When the polymerization reaction at the bottom of the ZMW pore occurs, the nucleotides labeled with different fluorescence will be retained by the polymerase for tens of milliseconds in the fluorescence detection region of the small pore, and the fluorescent label will fluoresce under the excitation of the laser beam (Excitation), according to the type of fluorescence can determine the type of dNTP. After the reaction is completed, the fluorescent label will be excised by the polymerase to disperse the ZMW pore. Other dNTPs that are not involved in the synthesis do not enter the fluorescent signal detection area and do not enter the fluorescent signal detection area. In SMRT sequencing, the sample preparation process involves the steps of breaking, end-filling, ligation, and sequencing of the sample DNA. The amount of sample required for sequencing is small, the reagents used in sample preparation are few, and the scanning and washing processes are omitted during the sequencing process, so sequencing takes less time.


    Nanopore single molecule technology
    The sequencing technology is completely different from the first two sequencing technologies. The core of the technology is to place a special lipid bilayer containing a pair of electrodes on one side of a micropore in a bilayer. An exonuclease is bound to a plurality of nanopores composed of alpha hemolysin. When the DNA template enters the channel, the exonuclease in the channel "holds" the DNA molecule, sequentially cleaves the DNA bases that pass through the nanopore, and each base passes through the nanopore, creating a blockade, according to Blocking the change in current can detect the type of the corresponding base, and finally the sequence of the DNA molecule.


    One of the major advantages of nanopore single-molecule sequencing technology is that the instrument is simple to construct and inexpensive to use; because it does not require the labeling of nucleotides, nor does it require complex optical detection systems (such as laser emitters and CCD signal acquisition systems). Direct sequencing of RNA molecules. At the same time, because it directly detects the characteristic current of each base, it can sequence the modified base, which is of great value for epigenetic research; the disadvantage is that it uses hydrolysis sequencing. Repeated sequencing is not possible and a satisfactory sequencing accuracy cannot be achieved.


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    Through nearly ten year’s hard working and depend on our professional work team, we are proud of satisfying the needs of our clients both at home and abroad, which across more than 50 countries and districts. We always devote ourselves to providing you with the best and professional service. Our products including: Total RNA Sequencing, pacific biosciences, single cell transcriptomics, single cell genomics, etc.